蛋白質(zhì)磷酸化是生物界 普遍，也是 重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，20世紀50年代以來一直被生物學家看作是一種動態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程。在細胞中，大概有1/3的的蛋白質(zhì)被認為是通過磷酸化修飾的。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學過程密切相關，如DNA損傷修復、轉錄調(diào)節(jié)、信號傳導、細胞凋亡的調(diào)節(jié)等。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過程的機理，進一步認識生命活動的本質(zhì)。近年來隨著蛋白質(zhì)組技術的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)磷酸化的研究越來越受到廣泛的關注。
蛋白質(zhì)磷酸化在細胞信號轉導中的作用
磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的必不可少的工具，因此研究蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化反應并確定成熟簡便的合成路線就變得非常重要。目前為止，多肽的磷酸化修飾主要有后磷酸化法和單體法兩種合成方法。后磷酸化法是多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側鏈羥基進行磷酸化；單體法則是將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，這種方法較后磷酸化法操作更為簡便，已經(jīng)成為多肽磷酸化修飾的主要方法。
單體法修飾時，磷酸化的氨基酸由于側鏈修飾的較大基團產(chǎn)生的位阻而導致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會比較困難，尤其在含有多個磷酸化位點修飾時，合成將變得異常困難，并且 終產(chǎn)物成分復雜，難以分離，產(chǎn)率極低。因此，當肽鏈中多個位點進行磷酸化時，可以考慮采用后磷酸化法，其合成過程主要就是在多肽合成結束之后，選擇性的脫去要標記氨基酸的側鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側鏈不保護的氨基酸進行反應。側鏈保護基在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化時，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷酰基，完成反應。
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成功案例:
序列NH2-TERD(pS)D(pT)DVE****PPGRPAEVH***AQPFGFID(pS)D(pS)DA***Y-CONH2，四個磷酸化修飾位點。
HPLC分析：
MS分析：