熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)
熒光共振能量轉移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發態能量轉移到受體激發態的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡單等優點。
用于FRET試驗的染料是可以相同的。但在大多數應用中其實是使用不同的染料。簡單地說，熒光共振能量轉移是在供體基團的激發狀態下由一對偶極子介導的能量從供體(染料1)向受體(染料2)轉移的過程。通常，供體 （Donor）熒光基團的發射光譜要與受體（Acceptor）基團的吸收光譜有一定的重疊。當這兩個熒光基團間的距離合適時（10 – 100 ?)），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象。能量轉移發生方式依賴于受體的化學結構：
-
a) 被轉化為分子的振動，即發生能量轉移熒光熄滅。(受體是猝光劑)
-
b) 發射更強于受體本身的特征熒光，造成次級熒光光譜的紅移。 (受體是熒光發射體)。
一個供體基團（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當該底物未被切斷時，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測不到熒光。當該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強度的變化進行監測。
FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應過程可被連續監測，為酶活性的檢測提供了一個便捷的方法。供體/受體對的肽鍵水解后產生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當FRET肽是完整的，表現出的是內部的熒光猝滅，但當供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會釋放出熒光，此熒光可被連續檢測，從而可對酶的活性進行定量分析。
FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：
-
肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動力特征和功能特征。
-
對新的蛋白水解酶的篩選和檢測。
-
對多肽折疊的構象研究。
以下是一些用于FRET的標準染料組合::
-
Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
-
Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
-
Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP): MCA/Lys(Dnp).
-
Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp): Abz/Tyr (NO2), Abz/EDDnp
-
Dabcyl and Glu(EDANS)
在蛋白酶的多肽底物內經共振能量轉移引發熒光猝滅的供體-接受對
|
|
波長(nm)
|
|
猝滅劑
|
熒光團
|
激發波
|
發射波
|
|
Dabcyl
Dansyl
DNP
DNP
DNP
Tyr (NO2)
|
Edans
Trp
Trp
MCA
Abz
Abz
|
336
336
328
328
328
320
|
490
350
350
393
420
420
|
常規RET供體-接受對的福斯特臨界距離（Forster Critical Distance）
|
Donor
|
Aceptor
|
Forster Distance
(Nanometers)
|
|
Tryptophan
IAEDANS (1)
BFP
Dansyl
Dansyl
CFP
CF (3)
Fluorescein
Cy3
GFP
BODIPY FL (4)
Rhodamine 6G
FITC
B-Phycoerythrin
Cy5
|
Dansyl
DDPM (2)
DsRFP
FITC
Octadecylrhodamine
GFP
Texas Red
Tetramethylrhodamine
Cy5
YFP
BODIPY FL (4)
Malachite Green
Eosin Thiosemicarbazide
Cy5
Cy5.5
|
2.1
2.5-2.9
3.1-3.3
3.3-4.1
4.3
4.7-4.9
5.1
4.9-5.5
>5.0
5.5-5.7
5.7
6.1
6.1-6.4
7.2
>8.0
|
(1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
(2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene